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CRISPR-HOT:一種為特定基因和細胞「著色」的新工具

來源 : 亞洲健康互聯海外中心
update : 2020/03/03
人肝細胞的超微結構定義:透過對角蛋白進行著色,人肝導管細胞中骨架的精細結構細節(藍色)變得可見。圖片來於:荷蘭哈勃雷赫特研究所德里拉·亨德里克斯、貝內塔塔·阿爾泰吉亞尼

荷蘭哈勃雷赫特研究所的漢斯·克利夫爾斯團隊開發出一種新的基因工具,用於標記人類器官或微型器官中的特定基因。他們使用這種稱為CRISPR-HOT的新方法,來研究肝細胞如何分裂,以及DNA過多的異常細胞如何出現。透過使癌症基因TP53無法正常工作,他們發現異常肝細胞的非結構化分裂更為頻繁,而這可能有助於癌症的發展。這項「使用獨立於同源性的CRISPR–Cas9精確基因組編輯快速高效地產生敲入式人類器官」的研究結果,於3月2日發表在《自然細胞生物學》上。

類器官是可以在實驗室中生長的微型器官。這些小器官是從很小的組織中長出來的,這對於各種器官都是可能的。基因改變這些類器官的能力,將極大地幫助研究生物學過程和疾病建模。然而,到目前為止,由於缺乏簡單的基因組工程方法,已證明難以產生遺傳改變的人類器官。
 
幾年前,研究人員發現,就像小分子剪刀一樣工作的CRISPR / Cas9,可以精確地切割DNA中的特定位置。這項新技術極大地幫助和簡化了基因工程。哈勃雷赫特研究所的黛麗拉·亨德里克斯表示,DNA中的小傷口可以活化細胞中的兩種不同修復機制,研究人員都可以使用這兩種機制,來迫使細胞吸收DNA的新部分。這些方法中的一種,稱為「非同源末端連接」,經常出錯,因此直到現在仍不常用來插入新的DNA片段。

研究員貝內塔塔·阿爾泰吉亞尼說:「由於一些早期的小鼠研究表明,可以透過非同源末端連接插入新的DNA片段,所以我們著手在人類器官中進行測試。」研究人員發現,透過非同源末端連接,將任何DNA片段插入人類器官,實際上比迄今為止使用的另一種方法更有效、更耐用。他們將新方法命名為“CRISPR-HOT”。

研究人員使用CRISPR-HOT將螢光標記插入人類類器官的DNA中,從而使這些螢光標記附著在他們想要研究的特定基因上。他們首先標記了腸道中非常罕見的特定類型細胞:腸內分泌細胞。這些細胞產生激素來調節例如葡萄糖水平、食物攝入和胃排空。因為這些細胞非常稀有,所以很難研究。然而,借助CRISPR-HOT,研究人員可以輕鬆地將這些細胞「塗成」不同的顏色,然後輕鬆地對其進行識別和分析。

其次,研究人員繪製了源自肝臟中特定細胞類型(膽管細胞)的類器官。他們使用CRISPR-HOT可視化了角蛋白,即參與細胞骨架的蛋白質。現在,他們可以以高分辨率,查看這些角蛋白的詳細資訊,研究人員以超結構化的方式發現了它們的組織。當細胞特化或分化時,這些角蛋白也會改變表達。因此,研究人員預計,CRISPR-HOT可用於研究細胞命運和分化。

肝細胞分裂異常
在肝臟內,有許多肝細胞含有正常細胞DNA的兩倍甚至更多。目前尚不清楚這些細胞是如何形成的,以及由於這種數量異常的DNA是否能夠分裂。老年人含有更多這些異常肝細胞,但尚不清楚它們是否與癌症等疾病有關。研究人員使用CRISPR-HOT標記了肝細胞類器官中細胞分裂機制的特定成分,並研究了細胞分裂的過程。阿爾泰吉亞尼說:「我們看到“正常”的肝細胞分裂非常有序,總是沿某個方向分裂為兩個子細胞。亨德里克斯說:「我們還發現了幾個分裂區,其中形成了異常的肝細胞。我們第一次看到“正常”的肝細胞如何變成異常的。」

除此之外,研究人員研究了經常在肝癌中發現的TP53基因突變,對肝細胞異常細胞分裂的影響。沒有TP53,這些異常肝細胞分裂的頻率就會更高。這可能是TP53促進癌症發展的方式之一。

研究人員認為,CRISPR-HOT可應用於多種類型的人類類器官、可視化任何基因或細胞類型,以及研究許多與發育和疾病相關的問題。